Umělá aktivace pohybu spermií in vitro


Artificial activation of sperm motility in vitro

Aim: The sperm activation method is a modern methodological approach that is used more and more often in practice. The number of studies focused on methods of artificial activation of human sperm motility are constantly increasing. Standard sperm selection methods can fail in some cases, among other things, because very young sperm are isolated that have not yet completed their development. In these cases, artificial stimulation of their movement can have a positive effect and greatly facilitate and faster the process of selecting suitable sperm. Methylxanthines are most often used as activating agents. However, opinions on the safety of using these substances on sperm are not uniform. The aim of the thesis is to present current knowledge about artificial activation of sperm motility for in vitro fertilization and subsequent embryonic development. Methodology: Research of relevant literature in Web of Science, Scopus, PubMed/Medline databases. Results and conclusion: The literature analysis shows that this method is safe and effective in the selection of immotile spermatozoa. Scientific studies have been conducted to verify the safety and reliability of this method. The conclusion of these studies is the positive impact of this method of selection, especially in cases of sperm obtained from testicular tissue after method testicular sperm extraction. In these cases, the method of artificial sperm activation facilitated and accelerated the selection of sperm before intracytoplasmic sperm injection. Undamaged spermatozoa, which are immobile due to incomplete maturation, were activated.

Keywords:

spermatozoa – In vitro fertilization – motility – theophylline


Authors: P. Trávník 1-3 ;  M Ješeta 1,4,5 ;  R. Hűttelová 1,6 ;  R. Křen 1,7 ;  L. Landsmann 1,8 ;  A. Nesvadbová 1,9,10 ;  G. Tauwinklová 1,2,11
Authors‘ workplace: Výbor Asociace reprodukční embryologie z. s. 1;  Repromeda s. r. o., Brno 2;  IPVZ, Praha 3;  Gynekologicko-porodnická klinika LF MU a FN Brno 4;  FAPPZ ČZU, Praha 5;  Cube IVF, Praha 6;  GENNET s. r. o., Praha 7;  UNICA Prague s. r. o., Praha 8;  IVF Clinic, Olomouc 9;  Přírodovědecká fakulta, UP v Olomouci 10;  Ústav histologie a embryologie, LF MU, Brno 11
Published in: Ceska Gynekol 2024; 89(2): 134-138
Category:
doi: https://doi.org/10.48095/cccg2024134

Overview

Cíl studie: Metoda aktivace spermií je moderní metodický přístup, který se v praxi používá stále více. Neustále přibývá nových studií zaměřených na metody umělé aktivace motility lidských spermií. Standardní metody výběru spermií mohou v některých případech selhat mimo jiné i proto, že jsou izolovány spermie velice mladé, které ještě nedokončily svůj vývoj. V těchto případech může mít umělá stimulace jejich pohybu pozitivní efekt a velice usnadnit a urychlit proces výběru vhodných spermií. Jako aktivační činidla se nejčastěji využívají methylxanthiny. Názory na bezpečnost použití těchto látek na spermie však nejsou jednotné. Cílem práce je prezentovat současné poznatky o umělé aktivaci motility spermií na in vitro fertilizaci a následný embryonální vývoj. Metodika: Rešerše relevantní literatury v databázích Web of Science, Scopus, PubMed/Medline. Výsledky a závěr: Z literární analýzy vyplývá, že je tato metoda bezpečná a účinná při výběru nepohyblivých spermií. Byly provedeny vědecké studie zaměřené na ověření bezpečnosti a spolehlivosti této metody. Závěrem těchto studií je pozitivní dopad tohoto způsobu výběru především u případů spermií získávaných z varletní tkáně po metodě TESE (testicular sperm extraction). V těchto případech metoda umělé aktivace spermií usnadnila a zrychlila výběr spermií před intracytoplazmatickou injekcí spermie. Aktivovány byly spermie nepoškozené, které jsou nepohyblivé z důvodu nedokončení své maturace.

Klíčová slova:

spermie – in vitro fertilizace – motilita – teofylin

Úvod

Jednou z metod, která slouží ke zvýšení účinnosti oplození a podpoře dalšího vývoje embryí, je v případě handicapovaných spermií metoda aktivace pohybu spermií v podmínkách in vitro ve spojení s intracytoplazmatickou injekcí spermie (ICSI). Počátky použití aktivace pohybu spermií ve spojení s metodami asistované reprodukce se datují do začátku 90. let minulého století [1–3].

Vztah mezi pohyblivostí spermie a kvalitou oplození

Spermie z jednoho ejakulátu představují značně heterogenní populaci, jen část z nich má schopnost oplodnit oocyt [4,5]. Přirozená selekce spermií je založena na průchodu spermie labyrintem ženských pohlavních cest, tedy na preferenci pohyblivých spermií [6]. Motilita je základní vlastnost spermií, která je často využívaná i při jejich separaci před použitím pro in vitro fertilizaci (IVF). Nicméně bylo prokázáno, že nejen přirozeně pohyblivé spermie mají lepší schopnost oplodnit a zajistit kvalitní vývoj embrya, ale že selekci vhodných spermií umožní i pohyb uměle aktivovaný, dovolující odlišit vitální spermie schopné oplodnit vajíčko a zajistit jeho normální vývoj [7].

Pokud jsou například spermie izolovány přímo z varletní tkáně (při metodě TESE – testicular sperm extraction), jsou izolovány často nezralé spermie, které mají špatný pohyb a většina takto získaných spermií je nepohyblivých [8]. Absence pohybu v tomto případě ale není způsobena poškozením spermie, ale její nedostatečnou maturací.

Table 1. Obrázek znázorňuje mechanizmus aktivace pohybu spermie. Fig. 1. The figure shows mechanism of sperm motility activation.
Obrázek znázorňuje mechanizmus aktivace pohybu spermie. </br>Fig. 1. The figure shows mechanism of sperm motility activation.
A – Proteinkináza A (PKA) je aktivována cyklickým adenosinmonofosfátem (3’,5‘-cAMP). Aktivní enzym spouští kaskádu fosforylace kináz (K1, K2, ...), když aktivuje další kinázy vazbou fosfátové skupiny (PO4 3–) na tyrosin neaktivních enzymů za účasti adenosintrifosfátu (ATP) a tím je aktivuje. B – Proces aktivace kináz antagonizuje odštěpením fosfátové skupiny (PO4 3–) enzym serin-tyrosin fosfatáza.A – Protein kinase A (PKA) is activated by cyclic adenosine monophosphate (3',5'-cAMP). The active enzyme triggers the cascade of kinase phosphorylation (K1, K2, ...) when it activates other kinases by binding a phosphate group (PO4 3–) to the tyrosine of inactive enzymes with the participation of adenosine triphosphate (ATP) and thereby activates them. B – The process of kinase activation antagonizes the serine-tyrosine phosphatase (STP) enzyme by splitting off the phosphate group (PO4 3–).

Fyziologie pohybu spermie

Pohyb bičíku spermií je poháněn fosforylací axonemálních zevních dyneinových ramének spojenou s hydrolýzou adenosintrifostátu (ATP), která dodává energii potřebnou pro posouvání mikrotubulových dubletů v axonemě, jehož výsledkem je ohýbání bičíku [9,10] podmiňující dopředný rotační pohyb spermie.

Centrální úlohu v regulaci této aktivity mají zejména kalciové ionty a na cyklickém adenosinmonofosfátu (cAMP) závislá cesta proteinkinázy A (PKA) (obr. 1). Bylo prokázáno, že cAMP je primárním signálem pro nástup motility spermií [11–14].

Dalšími činiteli jsou kalciový kanál CatSper přítomný na membráně bičíku spermie, který je řízen napětím a pH, které je zase řízeno draslíkovými a sodíkovými kanály a ligandami ze sekretu vejcovodu [15]. Vzestup koncentrace kalcia v cytoplazmě společně se vzrůstem koncentrace hydrogenkarbonátového iontu vede k aktivaci atypické solubilní adenylátcyklázy (sAC), která syntetizuje cAMP. To vede k aktivaci PKA a následné kaskády fosforylace proteinů vyvolané tyrosinkinázami a vyvažované serin/tyrosin fosfatázami, které společně regulují motilitu [16].

Antagonisty sAC syntetizující cAMP jsou fosfodiesterázy, které cAMP odbourávají za vzniku 5’-AMP. V lidských spermiích jsou přítomné jejich izoenzymy PDE1A a PDE3A [17].

 

Mechanizmus umělé aktivace pohybu

K aktivaci pohybu lidských spermií byla vyzkoušena řada látek [3,18–20].

Nejčastěji užívanými sloučeninami pro podporu pohyblivosti spermií in vitro jsou inhibitory fosfodiesterázy [21]. Principem umělé aktivace pohybu spermií je zvýšení koncentrace cAMP v cytoplazmě spermií inhibicí fosfodiesteráz, které cAMP odbourávají, není tedy ovlivněna syntéza cAMP (obr. 2). Velice často se k těmto účelům používá teofylin (1,3-dimethyl-7H-purin-2,6-dion; 1,3-dimethylxanthin) patřící podobně jako kofein či teobromin do skupiny alkaloidů methylxantinů. Methylxantiny jsou široce rozšířené látky, které se často používají jako léčiva při astmatu a dalších respiračních onemocněních.

Pomocí umělé aktivace dojde k aktivaci pohybu u nezralých spermií, které se po izolaci z varlat nehýbou. Tyto pohyblivé spermie jsou následně použity pro IVF. Aktivace pohybu spermií je výrazně zviditelní a usnadní jejich výběr ze vzorku (a zkrátí tak dobu výběru spermií). Navíc u mnoha vzorků krvavé varletní tkáně s pouze malým počtem spermií byly spermie identifikovány až po aktivaci. Z tohoto důvodu se někdy aktivace spermií používá i v diagnostických vzorcích TESA (testicular sperm aspiration) [22].

Image 1. Na obrázku je znázorněn mechanizmus zvyšování koncentrace cyklického adenosinmonofosfátu v bičíku spermieFig. 2. On the fi gure is demonstrated the mechanism of increasing the concentration of cyclic adenosine monophosphate in the sperm fl agellum.
Na obrázku je znázorněn mechanizmus zvyšování koncentrace cyklického adenosinmonofosfátu v bičíku spermie</br>Fig. 2. On the fi gure is demonstrated the mechanism of increasing the concentration of cyclic adenosine monophosphate in the sperm fl agellum.
A – Schéma bičíku spermie s aktivní fosfodiesterázou. Solubilní adenylátcykláza (sAC) syntetizuje cyklický adenosinmonofosfát (3’,5‘-cAMP), přitom utilizuje adenosintrifosfát (ATP). Současně fosfodiesteráza (PDE) přeměňuje cyklický adenosinmonofosfát na neaktivní adenosinmonofosfát (5‘-AMP). Tímto mechanismem je udržována stabilní koncentrace aktivního cyklického adenosinmonofosfátu. B – Schéma bičíku spermie s inhibovanou fosfodiesterázou. Solubilní adenylátcykláza (sAC) syntetizuje cyklický adenosinmonofosfát (3’,5‘-cAMP). Fosfodiesteráza (PDEi) je inaktivovaná vazbou inhibitoru (i) a cyklický adenosinmonofosfát (3’,5‘-cAMP) neinaktivuje a ten se hromadí, což stimuluje pohyb spermie.A – Diagram of a sperm fl agellum with active phosphodiesterase. Soluble adenylate cyclase (sAC) synthesizes cyclic adenosine monophosphate (3',5'-cAMP), while utilizing adenosine triphosphate (ATP). Simultaneously, phosphodiesterase (PDE) converts cyclic adenosine monophosphate to inactive adenosine monophosphate (5'-AMP). Stable concentration of active cyclic adenosine monophosphate is maintained by this mechanism. B – Diagram of a phosphodiesterase-inhibited sperm fl agellum. Soluble adenylate cyclase (sAC) synthesizes cyclic adenosine monophosphate (3',5'-cAMP). Phosphodiesterase (PDEi) is inactivated by binding of inhibitor (i) and cyclic adenosine monophosphate (3',5'-cAMP) does not inactivate and accumulates, stimulating sperm motility.

Indikace k použití aktivace pohybu

Indikací umělé aktivace pohybu spermií je TESE [23,24]. Ošetření testikulárních spermií získaných TESE teofylinem vedlo ke zvýšení klinické pregnancy rate z 23 % na 53 % [25].

Další indikací použití aktivace pohybu jsou případy těžké asthenozoospermie [26], případně nekrozoospermie [27]. Velice efektivní je také tato metoda při manipulaci s rozmraženými spermiemi po TESE [25].

 

Potenciální rizika použití metody

Do současné doby nebyl publikován případ vrozené vady v souvislosti s použitím umělé aktivace pohybu spermií. Aydos a Aydos poukázali na potenciální riziko teratogenního účinku dimetylxanthinů [29] s odkazem na publikaci o výskytu vrozených vad u myší vystavených vysokým dávkám (stovky miligramů na kilogram a den) paraxanthinu (1,7-dimethylxantin) v průběhu březosti [29]. Při použití této metody je důležité nevystavovat oocyty těmto látkám a pečlivě odstranit methylxanthin z kultivačního média, ve kterém se časná embrya vyvíjí [27]. Novější publikace zjistila, že paraxanthin není mutagenní ani genotoxickou látkou [30]. Pro bezpečnost aplikace látek ze skupiny dimetylxanthinů svědčí i široké používání léků z této skupiny v humánní medicíně bez teratogenních účinků. Pro umělou aktivaci pohybu spermie se navíc využívají nízké koncentrace aktivní látky a jejich působení na spermie je velmi krátkodobé, využívá se časově omezeného efektu přechodného vzestupu cAMP.

Image 2. Obrázek znázorňuje postup aktivace pohybu spermií pomocí inhibitoru fosfodiesterázy.Fig. 3. The fi gure shows procedure for activating sperm movement using a phosphodiesterase inhibitor.
Obrázek znázorňuje postup aktivace pohybu spermií pomocí inhibitoru fosfodiesterázy.</br>Fig. 3. The fi gure shows procedure for activating sperm movement using a phosphodiesterase inhibitor.
A – Petriho miska umístěná na vyhřívané desce obsahuje kapku suspenze spermií (2) a kapku čistého media (3). Do kapky suspenze spermií je pipetou (1) odměřen roztok inhibitoru, který je aplikován k jedné straně kapky suspenze. B – Po aktivaci spermie jsou pohyblivé spermie sbírány ICSI pipetou (4a, b) a přeneseny do kapky čistého media.A – Petri dish placed on a heated plate contains a drop of sperm suspension (2) and a drop of clean medium (3). Inhibitor solution is measured into a drop of sperm suspension with a pipette (1), which is applied to one side of the drop of suspension. B – After sperm activation, motile spermatozoa are collected with an ICSI pipette (4a, b) and transferred to a drop of clean medium.

Doporučený postup

V současné době je dostupný preparát GM501 SpermMobil (PLANER LIMITED, GYNEMED Medizinprodukte GmbH & Co. KG), založený na účinku inhibitoru fosfodiesterázy teofylinu [31], který se jinak používá také pro léčbu astmatu [32] a přirozeně se nachází např. v kakaových bobech [33] nebo čajových lístcích [34].

Roztok GM501 SpermMobil je zahřát na 37 °C, naekvilibruje se v atmosféře se zvýšenou koncentrací oxidu uhličitého. Na topnou desku (37 °C) je umístěna Petriho miska s kapkou suspenze spermií v médiu pro přípravu spermií o objemu cca 30–40 µl. Přidá se 3–4 µl zahřátého roztoku GM501 SpermMobil, a to z jedné strany, opačné, než ze které mají být nasávány spermie. Po 10 min je možno nabírat aktivované spermie (aktivační účinek nastoupí po několika minutách a trvá až 1 hod). Nabrané spermie jsou přeneseny s minimem tekutiny do kapky čistého media (obr. 3).

 

Závěr

Umělá aktivace pohybu spermií představuje účinný a bezpečný postup pro selekci vitálních spermií schopných oplodnit oocyt a umožnit vývoj embrya v případech, kdy není možno získat spontánně pohyblivé spermie.


Sources

1. Yovich JM, Edirisinghe WR, Cummins JM et al. Influence of pentoxifylline in severe male factor infertility. Fertil Steril 1990; 53 (4): 715–722. doi: 10.1016/s0015-0282 (16) 53470-0.

2. Imoedemhe DA, Sigue AB, Pacpaco EA et al. Successful use of the sperm motility enhancer 2-deoxyadenosine in previously failed human in vitro fertilization. J Assist Reprod Genet 1992; 9 (1): 53–56. doi: 10.1007/BF01204115.

3. Tesarik J, Mendoza C, Carreras A. Effects of phosphodiesterase inhibitors caffeine and pentoxifylline on spontaneous and stimulus-induced acrosome reactions in human sperm. Fertil Steril 1992; 58 (6): 1185–1190. doi: 10.1016/s0015-0282 (16) 55567-8.

4. Sousa AP, Amaral A, Baptista M et al. Not all sperm are equal: functional mitochondria characterize a subpopulation of human sperm with better fertilization potential. PLoS One 2011; 6 (3): e18112. doi: 10.1371/journal.pone.0018112.

5. Oseguera-López I, Ruiz-Díaz S, Ramos-Ibeas P et al. Novel techniques of sperm selection for improving IVF and ICSI outcomes. Front Cell Dev Biol 2019; 7: 298. doi: 10.3389/fcell.2019.00298.

6. Sakkas D, Ramalingam M, Garrido N et al. Sperm selection in natural conception: what can we learn from Mother Nature to improve assisted reproduction outcomes? Hum Reprod Update 2015; 21 (6): 711–726. doi: 10.1093/humupd/ dmv042.

7. Verheyen G, Popovic-Todorovic B, Tournaye H. Processing and selection of surgically-retrieved sperm for ICSI: a review. Basic Clin Androl 2017; 27: 6. doi: 10.1186/s12610-017-0050-2.

8. Zhu J, Tsirigotis M, Pelekanos M et al. In vitro maturation of human testicular spermatozoa. Hum Reprod 1996; 11 (1): 231–232. doi: 10.1093/oxfordjournals.humrep.a019030.

9. Turner RM. Tales from the tail: what do we really know about sperm motility? J Androl 2003; 24 (6): 790–803. doi: 10.1002/j.1939-4640.2003.tb03123.x.

10. Turner RM. Moving to the beat: a review of mammalian sperm motility regulation. Reprod Fertil Dev 2006; 18 (1–2): 25–38. doi: 10.1071/rd05120.

11. Buffone MG, Wertheimer EV, Visconti PE et al. Central role of soluble adenylyl cyclase and cAMP in sperm physiology. Biochim Biophys Acta 2014; 1842 (12 Pt B): 2610–2620. doi: 10.1016/j.bbadis.2014.07.013.

12. Vadnais ML, Aghajanian HK, Lin A et al. Signaling in sperm: toward a molecular understanding of the acquisition of sperm motility in the mouse epididymis. Biol Reprod 2013; 89 (5): 127. doi: 10.1095/biolreprod.113.110163.

13. Tash JS, Means AR. Regulation of protein phosphorylation and motility of sperm by cyclic adenosine monophosphate and calcium. Biol Reprod 1982; 26 (4): 745–763. doi: 10.1095/biolreprod26.4.745.

14. Tash JS, Means AR. Cyclic adenosine 3’,5’ monophosphate, calcium and protein phosphorylation in flagellar motility. Biol Reprod 1983; 28 (1): 75–104. doi: 10.1095/biolreprod28.1.75.

15. Kaupp UB, Strünker T. Signaling in sperm: more different than similar. Trends Cell Biol 2017; 27 (2): 101–109. doi: 10.1016/j.tcb.2016.10.002.

16. Pereira R, Sá R, Barros A et al. Major regulatory mechanisms involved in sperm motility. Asian J Androl 2017; 19 (1): 5–14. doi: 10.4103/10 08-682X.167716.

17. Lefièvre L, de Lamirande E, Gagnon C. Presence of cyclic nucleotide phosphodiesterases PDE1A, existing as a stable complex with calmodulin, and PDE3A in human spermatozoa. Biol Reprod 2002; 67 (2): 423–430. doi: 10.1095/biolreprod67.2.423.

18. Tardif S, Madamidola OA, Brown SG et al. Clinically relevant enhancement of human sperm motility using compounds with reported phosphodiesterase inhibitor activity. Hum Reprod 2014; 29 (10): 2123–2135. doi: 10.1093/humrep/deu196.

19. Ibis E, Hayme S, Baysal E et al. Efficacy and safety of papaverine as an in vitro motility enhancer on human spermatozoa. J Assist Reprod Genet 2021; 38 (6): 1523–1537. doi: 10.1007/s10815-021-02160-x.

20. Lefièvre L, de Lamirande E, Gagnon C. The cyclic GMP-specific phosphodiesterase inhibitor, sildenafil, stimulates human sperm motility and capacitation but not acrosome reaction. J Androl 2000; 21 (6): 929–937.

21. Kovacic B, Vlaisavljevic V, Reljic M. Clinical use of pentoxifylline for activation of immotile testicular sperm before ICSI in patients with azoospermia. J Androl 2006; 27 (1): 45–52. doi: 10.2164/jandrol.05079.

22. Taşdemir I, Taşdemir M, Tavukçuoğlu S. Effect of pentoxifylline on immotile testicular spermatozoa. J Assist Reprod Genet 1998; 15 (2): 90–92. doi: 10.1007/BF02766832.

23. Liu J, Nagy Z, Joris H et al. Analysis of 76 total fertilization failure cycles out of 2732 intracytoplasmic sperm injection cycles. Hum Reprod 1995; 10 (10): 2630–2636.

24. Esfandiari N, Javed MH, Gotlieb L et al. Complete failed fertilization after intracytoplasmic sperm injection – analysis of 10 years’ data. Int J Fertil Womens Med 2005; 50 (4): 187–192.

25. Ebner T, Tews G, Mayer RB et al. Pharmacological stimulation of sperm motility in frozen and thawed testicular sperm using the dimethylxanthine theophylline. Fertil Steril 2011; 96 (6): 1331–1336. doi: 10.1016/j.fertnstert.2011. 08.041.

26. Ebner T, Shebl O, Mayer RB et al. Healthy live birth using theophylline in a case of retrograde ejaculation and absolute asthenozoospermia. Fertil Steril 2014; 101 (2): 340–343. doi: 10.1016/ j.fertnstert.2013.10.006.

27. de Mendoza MV, González-Utor AL, Cruz N et al. In situ use of pentoxifylline to assess sperm vitality in intracytoplasmic sperm injection for treatment of patients with total lack of sperm movement. Fertil Steril 2000; 74 (1): 176–177. doi: 10.1016/s0015-0282 (00) 00559-8.

28. Aydos K, Aydos OS. Sperm selection procedures for optimizing the outcome of ICSI in patients with NOA. J Clin Med 2021; 10 (12): 2687. doi: 10.3390/jcm10122687.

29. York RG, Randall JL, Scott WJ Jr. Teratogenicity of paraxanthine (1,7-dimethylxanthine) in C57BL/6J mice. Teratology 1986; 34 (3): 279–282. doi: 10.1002/tera.1420340307.

30. Purpura M, Jäger R, Falk M. An assessment of mutagenicity, genotoxicity, acute-, subacute and subchronic oral toxicity of paraxanthine (1,7-dimethylxanthine). Food Chem Toxicol 2021; 158: 112579. doi: 10.1016/ j.fct.2021.112579.

31. GM501 SpermMobil – Firemní návod. 2023 [online]. Available from: https: //mail.planer.com/__80258426005B6A5E.nsf/0/ 5D7B42F886764AFB8025 856000357A88/$File/ Gi140_V1-Sperm-Mobil.pdf.

32. Barnes PJ. Theophylline. Am J Respir Crit Care Med 2013; 188 (8): 901–906. doi: 10.1164/rccm. 201302-0388PP.

33. Apgar JL, Tarka SM Jr. Methylxanthine composition and consumption patterns of cocoa and chocolate products and their uses. In: Spiller GA (ed). Caffeine. Boca Raton (FL): CRC Press 1998: 171.

34. IARC Working Group on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans. Coffee, tea, mate, methylxanthines and methylglyoxal. IARC monographs on the evaluation of carcinogenic risks to humans. Lyon (FR): International Agency for Research on Cancer 1991; 51: 391–419.

ORCID autorů

P. Trávník 0000-0002-2966-923X

M. Ješeta 0000-0003-1778-3454

R. Hüttelová 0009-0001-1877-1060

R. Křen 0009-0002-3534-7816

L. Landsmann 0000-0001-5984-1232

A. Nesvadbová 0000-0001-7854-4268

G. Tauwinklová 0009-0001-3024-6357

Doručeno/Submitted: 20. 10. 2023
Přijato/Accepted: 24. 10. 2023
prof. MUDr. Pavel Trávník, DrSc.
REPROMEDA s. r. o.
Studentská 812/6
625 00 Brno
ptravnik@repromeda.cz
Labels
Paediatric gynaecology Gynaecology and obstetrics Reproduction medicine

Article was published in

Czech Gynaecology

Issue 2

2024 Issue 2

Most read in this issue
Login
Forgotten password

Enter the email address that you registered with. We will send you instructions on how to set a new password.

Login

Don‘t have an account?  Create new account