Screeningové vyšetření endometriálních NK buněk u vybraných infertilních pacientek
1. část – metodika a průběžné výsledky


Screening of endometrial NK cells in selected infertile patients
First part – Methods and current results

Introduction:
Generaly, natural killer cells (NK cells) are among the most important cells of our immune defense system. They are present in the blood, decidua but also in secretory endometrium.

Objective:
We investigate an association between high density of NK cells CD56+ and NK cells CD16+ into blood and secretory endometrium in patients with up to now unexplained recurrent miscarriage. At the same time, we focused on diagnosis of antiphospholipid syndrome, congenital trombophilic factors, stress factor, and lenght of hormonal contraception before conception.

Design:
Original work-prospective study.

Setting:
Genetics-Pilsen.

Methods:
We investigated 59 patients aged 25–41 (average 34) years with their history of 3–9 abortions. We monitored their blood cells by flow cytometry and endometrium obtained by hysteroscopy performed on the 22nd–24th day of the menstrual cycle. We concentrated on the cellular immunity focused on the identification of lymphocytes CD56+ and CD16+. ELISA method was used for identification of antiphospholipid antibodies.

Results:
Our study goes on, we are publishing our preliminary results.

We found a high density of endometrial NK cells CD56+ in 41/57, NK cells CD16+ in 40/57, both NK cells CD56+ and CD16+ in 36/57 patients. In 13 women, we identified only sporadically these cells in the secretory endometrium. NK cells CD56+ and NK cells CD16+ in the blood were all normal number in all our patients. Three of them have a homozygot form of Leiden mutation, and 18/57 primary antiphospholipid syndrome, 12 women have university education, four of them, medical doctors, have regular night services in the hospital.

Conclusion:
Overproduction of endometrial NK cells is associated with increased local activity of embryocytotoxic cytokines that may negatively affect pregnancy. Treatment of patients with pathological immunological findings must be solved individually, as we will show soon in part two of our study.

Keywords:
infertility, natural killer cells, endometrium


Autoři: Z. Ulčová-Gallová 1,2;  M. Pešek 3;  P. Chaloupka 3;  P. Mukešnábl 4;  M. Haschová 5;  P. Losan 1;  K. Bibková 1;  Z. Mičanová 1;  J. Cibulka 1
Působiště autorů: Genetika-Plzeň, s. r. o., přednosta MUDr. P. Lošan 1;  Gynekologicko-porodnická klinika LF UK, Plzeň, přednosta doc. MUDr . Z. Novotný, CSc. 2;  Mulačova nemocnice, gynekologicko-porodnické oddělení, přednosta MUDr. Z. Knaizl 3;  Šiklův patologicko-anatomický ústav LF UK a FN, Plzeň, přednosta prof. MUDr. M. Michal 4;  MN Privamed a. s., OKB, přednosta Ing. Z. Jeřábek 5
Vyšlo v časopise: Čes. Gynek.2017, 82, č. 5 s. 366-371

Souhrn

Úvod:
Přirození zabíječi (natural killer cells – NK bb) patří mezi jedny z nejdůležitějších buněk našeho imunitního obranného systému. Jsou přítomny v krvi, v decidue, ale i v sekrečním endometriu. Mají velký význam při implantaci, ale mohou svou zvýšenou buněčnou imunitou i negativně ovlivnit probíhající graviditu.

Cíl studie:
Sledujeme vztah hustoty NK bb CD56+ a CD16+ v krvi a v sekrečním endometriu u pacientek s doposud nevysvětleným opakovaným potrácením. Současně se zaměřujeme na diagnózu antifosfolipidového syndromu, vrozených trombofilních faktorů, stres a délku hormonální antikoncepce před početím.

Typ práce:
Původní práce – prospektivní studie.

Název a sídlo pracoviště:
Genetika-Plzeň, s.r.o.

Metodika:
Vyšetřovali jsme 59 žen ve věku 25–41 let (průměr 34), které měly v anamnéze tři až devět potratů. Sledovali jsme jejich krevní buňky průtokovou cytometrií a endometrium z hysteroskopie provedené 22.–24. den menstruačního cyklu. Soustředili jsme se především na analýzu buněčné imunity zaměřené na identifikaci lymfocytů se znaky CD56+ a CD16+. Antifosfolipidové protilátky jsme vyšetřovali pomocí ELISA metody.

Výsledky:
Studie pokračuje, prezentujeme průběžné výsledky.

Vysokou hustotu endometriálních NK bb CD56+ jsme nalezli u 41/57, NK bb CD16+ u 40/57, oboje, CD56+ a CD16+, pak u 36/57 pacientek. U 13 žen jsme tyto buňky v sekrečním endometriu nalezli jen sporadicky. NK bb CD56+ a CD16+ v krvi měly všechny pacientky zcela v normálních hodnotách. Tři z nich mají pozitivní leidenskou mutaci v homozygotní formě, 18/57 pak prokázaný antifosfolipidový syndrom, 12 je vysokoškolaček, čtyři z nich, lékařky, slouží pravidelně noční služby v nemocnici.

Závěr:
Nadprodukce NK buněk je spojena se zvýšenou aktivitou embryocytotoxických cytokinů, které mohou negativně ovlivnit těhotenství. Léčba pacientek i s patologickými imunologickými nálezy musí být řešena individuálně, což brzy ukážeme ve druhé části naší studie.

Klíčová slova:
neplodnost, natural killer cells, endometrium

ÚVOD

Není-li synchronizován neuro-endokrinně imunitní systém především v době implantace, pak proces otěhotnění různě selhává. Zanořování embrya do sekrečního endometria vyžaduje komplexní proces, při kterém vysoká denzita lokálních „přirozených zabíječů“ – natural killer cells (NK bb) může ovlivnit nejen iniciální, ale i pozdější průběh gravidity. Jako diagnostický test se v současné době používají především údaje o hladinách NK bb v krvi.

NK bb obecně patří mezi jedny z nejzákladnějších heterogenních představitelů buněčné imunity vůbec. Jsou charakterizované přirozenou cytotoxicitou, podílejí se tedy na antiinfekční imunitě, ničí viry a bakterie hlavně tím, že produkují cytotoxické cytokiny nebo jsou těmito cytokiny právě aktivovány. Podílejí se také na destrukci tumorózní tkáně. NK bb patří mezi lymfocyty. Pro imunologii reprodukce jsou významnější ty buňky, kterou nesou na sobě znak CD56+ a CD16+. Míra cytotoxicity závisí na expresi znaků. NK bb mají také regulační funkci za podpory T-regulačních lymfocytů a dendritických buněk, jsou zvýšené v době implantace a jejich cytotoxický charakter může být umocněn v případě převahy Th1 buněčné odpovědi [3, 4]. Prosperující gravidita vyžaduje vybalancovaný poměr těchto buněk. NK bb mají tedy regulační i efektorové funkce (např. rejekce transplantátu apod.). Dnes už se ví [1, 2, 4, 8, 9], že např. podle denzity exprese znaků můžeme určit NK bb s vysokou mírou cytotoxicity nebo naopak velmi malou. NK bb mohou mít na sobě celou řadu znaků, my jsme si vybrali pro naši studii NK buňky exprimující znaky CD56+ a CD16+. Tyto znaky jsme použili ke screeningovému průkazu NK bb v klidovém sekrečním endometriu pacientek opakovaně potrácejících.

Habituální potrácení (RSA) může mít multifaktoriální příčinu (genetickou, hormonální, anatomickou, infekční, hematologickou, psychogenní, ale i imunologickou). Z imunologické příčiny velmi často diagnostikujeme antifosfolipidový syndrom, buď primární, nebo sekundární. Multifaktoriální příčina bývá častější a je cíleně léčena. I přes pečlivou léčbu ale může dojít k opakované ztrátě, která je už indikací k určení endometriálních NK bb, na něž se nyní zaměřujeme.

SOUBOR PACIENTEK A METODIKA

Z Poradny pro imunologiii reprodukce při Genetice-Plzeň, s.r.o., jsme po podepsaném informovaném souhlasu pečlivě vybrali 59 žen ve věku 25–41 (průměr 34) let, které měly tři až devět těhotenských ztrát v podobě dg. spontánní potrat nebo missed abortion a které jsme dále vyšetřovali pomocí diagnostické hysteroskopie. Z dalších anamnestických údajů jsme se zaměřili na délku období užívání hormonální antikoncepce před rozhodnutím založit rodinu. Sledovali jsme i pracovní anamnézu, a to především s ohledem na stres. U těchto už z poradny náhodně vybraných pacientek jsme provedli screeningové imunologické vyšetření k potvrzení nebo vyloučení antifosfolipidového syndromu, přítomnosti vrozených trombofilních stavů a dále jsme se zaměřili na analýzu buněčné imunity cílené na identifikaci lymfocytů se znaky CD56+ a CD16+. Rozšířenou buněčnou imunitu jsme sledovali v krvi a v endometriu. Krev odebíráme v ten samý den těsně před uvedením pacientky do krátké anestezie s analgezií před časovanou hysteroskopií 22.–24.den cyklu.

Hysteroskopii provádíme diagnostickým 5mm hysteroskopem v krátké celkové anestezii, vzhledem k časté nulliparitě s volně neprostupným děložním hrdlem a vzhledem k následné abrazi endometria. Dilatace děložního hrdla není většinou nutná. Výkon provádíme v ambulantním režimu, bez nutnosti hospitalizace. Nezaznamenali jsme žádnou komplikaci hysteroskopického výkonu v tomto souboru pacientek.

Počet leukocytů a lymfocytů vyšetřujeme metodou průtokové cytometrie na přístroji Cel-dyn Ruby (v laboratoři Privamed), subpopulace lymfocytů CD3+, CD4+, CD8+, CD19+ a NK bb. CD16+ 56+ pak na přístroji Coulter Beckman (v laboratoři ÚIA FN).

Profil antifosfolipidových protilátek proti kyselině fosfatidové, fosfatidyl serinu, fosfatidylinositolu, fosfatidylglycerolu, fosfatidyletanolaminu, proti beta-glykoproteinu 1, kardiolipinu, annexinu V v izotypech IgG a IgM vyšetřujeme pomocí konvenční ELISA metody.

Imunohistochemická vyšetření děložní sliznice připravované klasicky z parafinových řezů jsme provedli pomocí myší monoklonální protilátky CD16 a CD56 (NovocastraTM firmy Leica Microsystems GmbH, Velká Británie). Současně sledujeme v tkáni korporálního endometria i hormonální odezvu.

VÝSLEDKY

Z anamnéz pacientek jsme se dozvěděli, že hormonální antikoncepci (HAK) neužívalo nikdy pět žen, zbytek 2–15 let, více než 10 let užívalo hormonální antikoncepci 21 pacientek. Průměr HAK 6,9 let.

Pracovní zátěž: 15 pacietek mělo dělnickou profesi (dvě z nich pracují s chemikáliemi), 30 úřednickou dráhu, 12 žen bylo vysokoškolaček, z nich čtyři lékařky s pravidelnými 4–12 nočními službami do měsíce.

APA syndrom byl přítomný u 18/57.

Leidenskou mutaci, homozygotní formu, jsme diagnostikovali celkem u tří pacientek.

Buněčná imunita v krvi u všech sledovaných pacientek vykazovala zcela normální rozložení lymfocytů pro znaky CD3+, CD4+, CD8+, CD19+, CD16+, CD56+.

Tabulka 1 prezentuje nález endometriálních NK bb CD56+ a NK bb CD16+. Nalezli jsme vysokou denzitu NK bb CD56+ u 41/57, a NK bb CD16+ u 40/57, oboje NK bb CD56+ a NK bb CD16+ pozitivní nálezy pak u 36/56. U 13/57 jsme zvýšenou denzitu sledovaných NK bb ve sliznici děložní nenalezli.

Tab. 1. Výsledky imunohistochemického vyšetření endometria na NK bb CD56+ a NK bb CD16+ u pacientek opakovaně potrácejících
Výsledky imunohistochemického vyšetření endometria na NK bb CD56+ a NK bb CD16+ 
u pacientek opakovaně potrácejících

Obrázky 1 a 2 zobrazují mikroskopický nález sledovaných lymfocytů v endometriu sekreční fáze cyklu.

Immunohistochemie endometria při sledování NK bb CD16+
Obr. 1. Immunohistochemie endometria při sledování NK bb CD16+

Immunohistochemie endometria při sledování NK bb CD56+
Obr. 2. Immunohistochemie endometria při sledování NK bb CD56+

DISKUSE

Patologický nález periferních NK bb a endometriálních NK bb v animálním i lidském modelu je spojován se selháním reprodukce [8]. Na druhou stranu, NK bb obecně jsou velmi důležité v procesu implantace, v období decidualizace, participují na placentární invazi, usnadňují vaskularizaci za pomoci dalších imunologických faktorů, jako jsou makrofágy, dendritické buňky, které de facto modulují imunitní systém do odpovědi Th2/Treg. Je prokázáno [12], že nerovnováha v lokální buněčné imunitě může vést k porušení imunologické tolerance, k nastolení zvýšené fagocytární aktivity a přesmyku na Th1/Th17 [3], a tím i k nárůstu embryocytotoxických cytokinů, především TNFα a INFγ. Byla opakovaně prokazovaná zvýšená aktivita endometriálních NK bb právě u žen s opakovaným selháváním implantace, ale i ztráty časných plodů [15].

Někteří autoři [11] považují jen zvýšené hladiny periferních NK bb CD16+ za původce opakovaného implantačního selhávání s tím, že periferní NK indukují vznik endometriálních NK bb. Jiní autoři [13] informují o tom, že není významný rozdíl mezi počtem NK bb, B a T lymfocytů v porovnání s výsledkem léčby IVF a výsledkem prosperujících gravidit. Upozorňují i na to, že pacientky, které měly vysoké NK bb v krvi, neměly vyšší počet předchozích těhotenských ztrát po in vitro fertilizaci ve srovnání s pacientkami, které měly hladiny periferních NK bb zcela normální.

Je jasné, že zánětlivá imunitní reakce ovládaná právě buněčnou (NK bb) imunitou sehrává klíčovou úlohu při poruchách reprodukce (selhávání implantace, potraty). Je-li dysregulace mezi NK bb a T lymfocyty právě v endometriu, pak dochází ke vzniku cytotoxického prostředí přímo v děloze a tento stav pak vede ke zhoršené proliferaci a diferenciaci trofoblastu, porušení angiogeneze a zvýšenému oxidativnímu stresu v důsledku lokálních ischemických změn. U žen, které opakovaně potrácejí, jsou velmi časté abnormality T buněk se zvýšenou odpovědí Th1 a Th17 a sníženou Th2 [3, 6]. Lee et al. [7] prokázal, že u 76 % pacientek s prozatím idiopatickým opakovaným potrácením mělo v diferenciaci buněčné imunity velké odchylky právě směrem k nepříznivé Th1 buněčné odpovědi.

Prokázali jsme, že endometriální NK buňky jsou přítomné v různé hustotě i v „netěhotném“ endometriu. Tyto buňky proliferují v sekreční fázi během menstruačního cyklu [8, 9], během úspěšné implantace se ještě dál opakovaně množí, prakticky do konce prvního trimestru jako NK bb značené CD56bright a CD16+. Jejich původ je zahalen několika hypotézami, které ale zasahují do vysoce podrobných imunologických úvah, prakticky nad rámec našeho praktického sdělení.

Jedna z posledních prací [5] podtrhuje tu skutečnost, že periferní i endometriální NK bb se mohou výrazně odlišovat podle jejich receptorové exprese, množství a aktivity. Studie se zaměřila na sledování periferních počtů buněk se znaky CD45+, CD3+, CD56+, CD16+ průtokovou cytometrií a imunohistochemicky sledovala přítomnost NK bb CD56+ v endometriu luteální fáze u 268 žen po jednom, dvou a třech potratech. Studie porovnávala jednotlivé subsety s tím, že prokázala vyšší počty hodnoty periferních lymfocytů CD45 + CD3-DR + (p <0,01) a CD45 + CD3 + CD8 + DR + (p = 0,04), které byly spojeny s vyššími počty endometriálních NK bb. Studie ale neprokázala jednoznačnou spojitost mezi periferními a lokálními NK bb, ale domněnku, že by snad aktivované NK bb, B a T lymfocyty mohly poskytovat cytokiny pro diferenciaci endometriálních NK bb. Naše předběžné výsledky ale poukazují na to, že perifení NK bb jsou odlišné od děložních. Podle Vassiliadou et al. [15] dochází u potrácivých k narušení imunologické tolerance mezi matkou a plodem právě ve prospěch cytotoxických NK bb CD56dim. I když nemáme zatím možnost určit jemnou diferenciaci uterinních NK bb CD56bright od CD56dim (jedná se o zcela odlišné funkce), přece jenom se domníváme, že nápadně zvýšená denzita endometriálních obecně NK bb CD56+ a CD16+ informuje o vystupňované lokální buněčné imunitě v luteální fázi endometria, která může sehrávat důležitou roli i v implantaci a v průběhu časné gravidity. Kdyby se jednalo o imunogenní aktivitu směrovanou k toleranci matka-plod a ne k proliferaci prozánětlivých buněk a jejich faktorů, pak by pacientka opakovaně nepotrácela z důvodu právě imunologického selhávání.

Tang et al. [12] provedl analýzu 783 publikací z let 1950–2010 a zaměřil se na studie právě endometriálních a periferních NK bb, na jejich hustotu s ohledem na idiopatickou infertilitu. V rozboru prací vyčítá autorům, že laboratorní diagnostika abnormální hustoty NK bb, následný potrat nebo jeho rekurence směrovaná k léčbě, není dokumentovaná právě výsledkem, tedy úspěšnou graviditou. Tato kompilátní práce [12] přímo vyzývá k dalším studiím, jež potvrdí, nebo vyvrátí úlohu hodnocení NK bb, které jsou prediktivním screeningem pro cílenou imunoterapii u žen se sníženou plodností.

Jiné studie [10] vyzdvihují přednosti NK bb (sekrece i „hodných“ cytokinů, účast na angiogenezi apod.) v preimplantačním endometriu, především časné těhotenské deciduy. Upozorňuje však i na to, že zvýšená nadprodukce uterinních NK bb se snoubí se selháváním gravidity. Domnívá se, že tato patologická situace je dobře ovlivnitelná kortikoidní terapií. I tato studie vyzývá ke sledování endometriálních NK bb, kterými můžeme odhalit imunologický defekt v endometriu včas a který nás nasměruje k cílené budoucí léčbě pacientky.

V naší prezentované skupině infertilních pacientek téměř třetina z nich užívala hormonální antikoncepci více než 10 let, u většiny z nich jsme diagnostikovali ještě navíc antifosfolipidový syndrom, stres a jinou profesionální zátěž, která může narušit synchronizaci neuro-endokrinně imunitního systému. Multifaktoriální příčina snížené plodnosti v nastolení získané autoimunitní patologie ještě více prohlubuje problém buněčné a protilátkové imunity [14]. Vhodně stanovenou imunomodulační léčbou cílenou na NK bb a jiné faktory a výsledky našich pacientek sledovaných v této studii budeme publikovat v následujícím článku.

ZÁVĚR

Prokázali jsme důležitý fakt, že počty periferních NK bb nekorelují s hustotou endometriálních NK bb. Z našeho perspektivního sledování infertilních pacientek vyplývá, že endometriální NK bb sehrávají důležitou úlohu nejen fyziologickou, ale při vysoké hustotě i patologickou v podobě nadprodukce embryocytotoxických cytokinů [1].

Prof. MUDr. Zdenka Ulčová-Gallová, DrSc.

Genetika-Plzeň, s.r.o.

305 00 Plzeň

e-mail: ulcova-gallova@email.cz


Zdroje

1. De Maria, A., Bozzano, F., Cantoni, C., et al. Revisiting human natural killer cell subset function revealed cytolytic CD56 CD16+ NK cells as rapid producers of abudant IFN-gamma on activation. Proc Natl Acad Sci USA, 2011, 108, p. 728–732.

2. Eshadri, S., Sunkara, SK. Natural killer cells in female infertility and recurrent miscarriage: a systemic review and meta-analysis. Human Reprod Update, 2014, 20, p. 429–438.

3. Hanzlikova, J., Ulcova-Gallova, Z., Malkusova, I., et al. Th1-Th2 response and the atopy risk in patients with reproductive failure. Am J Reprod Immunol, 2009, 61, p. 213–220.

4. Krejsek, J., Kopecký, O. Klinická imunologie. Nucleus, 2004, s. 1–939.

5. Kuon, RJ., Vomstein, K., Weber, M., et al. The „killer cell story“ in recurrent miscarriage: Association between activated peripheral lymphocytes and uterine natural killer cells. J Reprod Immunol, 2017, 119, p. 9–14.

6. Kwak-Kim, J., Bao, S., Lee, SK., et al. Immunological modes of pregnancy loss: inflammation, immune effectors, and stress. Am J Reprod Immunol, 2014, 72, p. 129–140.

7. Lee, SK., Na, BJ., Kim, JY., et al. Determination of clinical cellular immune markers in women with recurrent pregnancy loss. Am J Reprod Immunol, 2013, 70, p. 398–411.

8. Leno-Duran, E., Munoz-Fernandez, R., Olivares, EG., et al. Liaison between natural killer cells and dendritic cells in human gestation. Cell Mol Immunol, 2014, 11, p. 449–455.

9. Manaster, I., Mandelboim, O. The unique properties of uterine NK cells. Am J Reprod Immunol, 2010, 63, p. 434–444.

10. Quenby, S., Farquharson, R. Uterine natural killer cells, implantation failure and recurrent miscarriage. Reprod Biomed Online, 2006, 13, p. 24–28.

11. Seshadri, S., Sunkara, SK. Natural killer cells in female infertility and recurrent miscarriage: a systematic review and metaanalysis. Hum Reprod Update, 2014, 20, p. 429–438.

12. Tang, AW., Alfirevic, Z., Quenby, S. Natural killer cells and pregnancy outcomes in women with recurrent miscarriages and infertility: a systemic review. Hum Reprod, 2011, 26, p. 1971–1980.

13. Thum, MY., Bhaskaran, S., Bansal, AS., et al. Simple enumerations of peripheral blood natural killer (CD56+NK) cells, B cells and T cells have no predictive value in IVF treatment outcome. Hum Reprod, 2005, 20, p. 1272–1276.

14. Ulcova-Gallova, Z., Bibkova, K., Micanova, Z., Losan, P., et al. Possible effect of extended use of hormonal contraception on increased levels of antiphospholipid antibodies in infertile women. Geburtshilfe Frauenheilkd. 2015, 75, p. 251–254.

15. Vassiliadou, N., Searle, RF., Bulmer, JN. Elevated expression of activation molecules by decidual lymphocytes in women suffering spontaneous early pregnancy loss. Hum Reprod, 1999, p. 194–200.

Štítky
Dětská gynekologie Gynekologie a porodnictví Reprodukční medicína

Článek vyšel v časopise

Česká gynekologie

Číslo 5

2017 Číslo 5

Nejčtenější v tomto čísle

Tomuto tématu se dále věnují…


Přihlášení
Zapomenuté heslo

Nemáte účet?  Registrujte se

Zapomenuté heslo

Zadejte e-mailovou adresu se kterou jste vytvářel(a) účet, budou Vám na ni zaslány informace k nastavení nového hesla.

Přihlášení

Nemáte účet?  Registrujte se